显微镜技术原理

显微镜技术   技术原理   微生物个体微小，用肉眼直接观察不到，必须借助显微镜才能观察到他的个体形态和细胞结构。在蛋白质结构等所需对物质的微观结构进行观察的研究中也都会用到各种显微镜。 现有的各种显微镜基本上都是由物镜和目镜组成，目镜的焦距很短，目镜的焦距很长，目镜的作用是得到物体放大的实像，目镜的作用是将物镜放大的实像作为物体，进一步放大成虚像。显微镜将物体放大的总倍数是物镜放大倍数乘以目镜放大的倍数。这样虽然目镜和物镜放大的倍数有限，但是显微镜总放大倍数就非常可观。   仪器结构和分类   普通光学显微镜是一种精密的光学仪器。早期的显微物镜仅由少数几块透镜组成，难于消除物像的像差和色差。近代的显微物镜已由一套精密磨制的透镜组成，已能较好地消除像差和色差，并能将物体放大1500～2000倍。 普通光学显微镜的构造可分为两大部分：即机械装置和光学系统。这两部分很好地配合，才能充分发挥显微镜的作用。 1.显微镜的机械装置 显微镜的机械装置包括镜座、镜筒、物镜转换器、载物台、推动器、粗动螺旋和微动螺旋等部件。 (1)镜座 镜座是显微镜的基本支架，由底座和镜臂两部分组成。在其上部连接有载物台和镜筒，是用于安装光学放大系统部件的基础。 (2)镜筒 镜筒上接接目镜，下接转换器。形成接目镜与接物镜(装在转换器下)间的暗室。 从镜筒的上缘到物镜转换器螺旋口之间的距离称为机械筒长。因为物镜的放大率是对一定的镜筒长度而言的。镜筒长度的变化，不仅放大倍率随之变化，而且成像质量也受到影响。因此，使用显微镜时，不能任意改变镜筒长度。国际上将显微镜的标准筒长定为160mm，此数字标在物镜的外壳上。 (3)物镜转换器 物镜转换器上可安装3～4个物镜，一般是3个物镜(低倍、高倍、油镜)，Nikon显微镜装有4个物镜。转动转换器，可以按需要 将其中的任何一个接物镜和镜筒接通，与镜筒上面的目镜构成一个放大系统。 (4)载物台 载物台中央有一孔，为光线通路。在台上装有弹簧标本夹和推动器。 (5)推动器 是移动标本的机械装置，由一横一纵两个推进齿轴和齿条构成。研究显微镜的纵横架杆上刻有刻度标尺，构成精密的平面坐标系。如需要重复观察已检查标本的某一物像时，可在第一次检查时记下纵横标尺的数值，下次按数值移动推动器，就可以找到原来标本的位置。 (6)粗调螺旋 粗调螺旋用于粗放调节物镜和标本的距离，老式显微镜粗调螺旋向前扭，镜头下降接近标本。新近出产的显微镜(如Nikon显微镜)镜检时，右手向前扭动使载物台上升，让标本接近物镜，反之则下降，标本远离物镜。 (7)微调螺旋 用粗调螺旋只能粗放地调节焦距，难于观察到清晰的物像，因而需要用微调螺旋做进一步调节。微调螺旋每转一圈镜筒仅移动0.1 mm(100μm)。新近出产的研究显微镜的粗调螺旋和微调螺旋是共轴的。 2.显微镜的光学系统 显微镜的光学系统由反光镜，聚光器，物镜，目镜等组成，光学系统使标本物像放大，形成倒立的放大物像。 (1)反光镜 早期的普通光学显微镜常用自然光检视标本，在镜座上装有反光镜。反光镜是由一平面和另一凹面的镜子组成，可以将投射在它上面的光线反射到聚光器透镜的中央，照明标本。不用聚光器时用凹面镜也能起汇聚光线的作用。用聚光器时，一般都用平面镜。新近出产的研究显微镜镜座上装有光源，并有电流调节螺旋，可通过调节电流大小来调节光照强度。 (2)聚光器 聚光器在载物台下面。一般由聚光透镜、虹彩光圈和升降螺旋组成。聚光器可分为明视场聚光器和暗视场聚光器。普通光学显微镜配置的都是明视场聚光器，明视场聚光器有阿贝聚光器、齐明聚光器和摇出聚光器。阿贝聚光器在物镜数值孔径高于0.6时会显示出色差和球差。齐明聚光器对色差、球差和慧差的校正程度较高，是明视场镜检中质量最好的聚光器，但它不适于4倍以下的物镜。摇出聚光器能将聚光器上透镜从光路中摇出满足低倍物镜(4×)大视场照明的需要。 聚光器安装在载物台下，其作用是将光源经反光镜反射来的光线聚焦于样品上，以得到最强的照明，使物像获得明亮清晰的效果。聚光器在光学系统中的位置可以通过其上的两个调节螺杆将光圈调小后进行聚中调节。其高低也可以调节，使焦点落在被检物体上，以得到最大亮度。一般聚光器的焦点在其上方1.25mm处，而其上升限度为载物台平面下方0.1mm。因此，要求使用的载玻片厚度应在0.8～1.2mm之间，否则被检样品不在焦点上，影响镜检效果。聚光器前透镜组前面还装有虹彩光圈，它可以开大和缩小，影响成像的分辨力和反差，若将虹彩光圈开放过大，超过物镜的数值孔径时，便产生光斑；若收缩虹彩光圈过小，虽反差增大，但分辨力下降。因此，在观察时一般应将虹彩光圈调节开启到视场周缘的外切处，使不在视场内的物体得不到任何光线的照明，以避免散射光的干扰。 (3)物镜 安装在镜筒前端转换器上的物镜利用入射光线时被检物像进行第一次造像，物镜成像的质量对分辨力有着决定性的影响。物镜的性能取决于物镜的数值孔径(numerical apeature简写为NA)，每个物镜的数值孔径都标在物镜的外壳上，数值孔径越大，物镜的性能越好。 物镜的种类很多，可从不同角度来分类： 根据物镜前透镜与被检物体之间的介质不同，可分为： 1)干燥系物镜 以空气为介质，如常用的40×以下的物镜，数值孔径均小于1。 2)油浸系物镜 常以香柏油为介质，此物镜又叫油镜头，其放大率为90×～100×，数值孔值大于1。 根据物镜放大率的高低，可分为： 1)低倍物镜 指1×～6×，NA值为0.04～0.15； 2)中倍物镜 指6×～25×，NA值为0.15～0.40； 3)高倍物镜 指25×～63×，NA值为0.35～0.95； 4)油浸物镜 指90×～100×，NA值为1.25～1.40。 根据物镜对像差和色差校正的程度来分类，可分为： 1)消色差物镜 是最常用的物镜，外壳上标有"Ach"字样，该物镜可消除红光和青光形成的色差。镜检时通常与惠更斯目镜(Huygens eyepiece)配合使用。 2)复消色差物镜 物镜外壳上标有“Apo”字样，除能校正红、蓝、绿三色光的色差外，还能校正黄色光造成的像差，通常与补偿目镜配合使用。 3)特种物镜 在上述物镜基础上，为达到某些特定观察效果而制造的物镜。如带校正环物镜、带视场光阑的物镜、相差物镜、荧光物镜、无应变物镜、无罩物镜、长工作距离物镜等。目前研究显微镜常用的物镜还有：半复消色差物镜(semi-APO)、平场物镜(Plan)、平场复消色差物镜(Plan Apo)、超平场物镜(Splan)、超平场复消色差物镜(Splan Apo)等。 、 (4)目镜 目镜的作用是把物镜放大了的实像进行第二次放大，并把物像映入观察者的眼中。目镜的结构较物镜简单，普通光学显微镜的目镜通常由两组透镜组成，上端的一组透镜又称为“接目镜”，下端的则称为“场镜”。上下透镜之间或在两组透镜的下方，装有由金属制的环状光阑或叫“视场光阑”，物镜放大后的中间像就落在视场光阑平面处，所以其上可安置目镜测微尺。 普通光学显微镜常用的目镜主要是惠更斯目镜，研究显微镜配有性能更好的目镜，如补偿目镜(K)、平场目镜(P)和广视场目镜(WF)等。照相时选用照相目镜(NFK)。   显微镜根据照明方法分类，有透射型与反射(落射)型二种。透射型显微镜是应用透射照明通过透明物体的打光方法。反射型显微镜是以物镜上方打光到(落射照明)不透明的物体上。 显微镜根据观察方法的差异分类，分为明视野显微镜、暗视野显微镜、相位差显微镜、偏光显微镜、干涉相位差显微镜、荧光显微镜等。每种显微镜一般又各有透射型和反射型二种。在这些显微镜中，特别是明视野显微镜是构成所有显微镜中组成最基本的基础。通过这种显微镜观察的物体，穿过透过(吸收)率、反射率，因场所不同而各不相同，这种物体被称为随照明光强度(振幅)变化振幅物体，无色透明物体只有在照明相位改变时，才能被肉眼观察到，由于明视野显微镜不能改变相位，所以对透明不染色标本不能被观察到。 显微镜根据成像原理不同，可以分为光学显微镜(OM)、透射电子显微镜(TEM)、扫描电子显微镜(SEM)、高压电子显微镜(HVEM)、分析电子显微镜(AEM)、场离子显微镜(FIM)、场发射电子显微镜(FEEM)、声学显微镜(AM)、扫描隧道显微镜(STM)和原子力显微镜（AFM）等。   仪器操作规程   1. 以YS2-H显微镜为例介绍光学显微镜的使用方法 ⑴ 观察前的准备 ① 显微镜从显微镜柜或镜箱内拿出时，要用右手紧握镜臂，左手托住镜座，平稳地将显微镜搬运到实验桌上。 ② 将显微镜放在自己身体的左前方，离桌子边缘约lOcm左右，右侧可放记录本或绘图纸。 ③ 调节光照。对于不带光源的显微镜，可利用灯光或自然光通过反光镜来调节光照，但不能用直射阳光，直射阳光会影响物像的清晰并刺激眼睛。将10×物镜转入通光孔，将聚光器上的虹彩光圈打开到最大位置，用左眼观察目镜中视野的亮度，转动反光镜，使视野的光照达到最明亮最均匀为止。光线较强时，用平面反光镜，光线较弱时，用凹面反光镜。对于自带光源的显微镜，可通过调节电阻旋钮来调节光照强弱。   ④ 光轴中心调节。显微镜在观察时，其光学系统中的光源、聚光器、物镜和目镜的光轴及光阑的中心必须跟显微镜的光轴同在一直线上。使用带视场光阑的显微镜时，先将光阑缩小，用10×物镜观察，在视场内可见到视场光阑球形多边形的物像。如此像不在视场中央，可利用聚光器外侧的两个调整旋钮将其调到中央，然后缓慢地将视场光阑打开，能看到光束向视场周缘均匀展开直至视场光阑的多边形物像完全与视场边缘内接，说明光线已经合轴。 ⑵ 低倍镜观察 镜检任何标本都要先用低倍镜观察，低倍镜视野较广，易于发现目标和确定检查的位置。 将标本片放置在载物台上，用标本夹夹住，移动推动器，使被观察的标本在物镜正下方，转动粗调节旋钮，使物镜调至接近标本处，用目镜观察并同时粗调节旋钮慢慢升起载物台(或下降镜筒)，直至物像出现，再用细调节旋钮物像清晰为止。用推动器移动标本片，找到合适的标本物像并将它移到视野中进行观察。 ⑶ 高倍镜观察 在低倍物镜观察的基础上转换高倍物镜。现在常用的显微镜，低倍、高倍物镜同焦的，在正常情况下，高倍物镜的转换不应碰到载玻片或其上的盖玻片。若使用不同型号的物镜，在转换物镜时要从侧面观察，避免镜头与玻片相撞。然后目镜观察，调节光照，使亮度适中，缓慢调节粗调节旋钮，使载物台上升(镜筒下降)，直至物像出现，再用细调节旋钮调至物像清晰为止，找到需观察的部位．并移至视野中央进行观察。 ⑷ 油镜观察 油浸物镜的工作距离(指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离)很短，一般在O.2 mm以内，再加上一些光学显微镜的油浸物镜没有“弹簧装置”，因此使用油浸物镜时要特别细心，避免由于“调焦”不慎而压碎标本片并使物镜受损。 使用油镜按下列步骤操作： ① 先用粗调节旋钮将载物台下降(或将镜筒提升)约2cm，并将高倍镜转出。 ② 在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。 ③ 从侧面注视，用粗调节旋钮将载物台缓缓地上升，(或镜筒下降)，使油浸物镜浸入香柏油中，使镜头几乎与标本接触。 ④ 从接目镜内观察，放大视场光阑及聚光器上的虹彩光圈(带视场光阑油镜开大视场光阑)，上调聚光器至顶位，使光线充分照明。用粗调节旋钮将载物台徐徐下降(或镜筒上升)，当出现物像一闪后改用细调节旋钮调至最清晰为止。如油镜已离开油面而仍未见到物像，必须再从侧面观察，重复上述操作。 ⑤ 观察完毕，下降载物台，将油镜头转出，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许乙醚乙醇混合液(乙醚2份，无水乙醇3份)或二甲苯，擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭2～3下即可(注意朝一个方向擦拭)。 ⑸ 将各部分还原，转动物镜转换器，使低倍物镜与载物台通光孔相对，再将载物台下降至最低，降下聚光器，反光镜与聚光器垂直，用一个干净罩子将接目镜罩好，以免目镜头沾污灰尘。最后用柔软纱布清洁载物台等机械部分，然后将显微镜放回柜内或镜箱中。 2. JSZ连续变倍体视显微镜使用方法 ⑴ 灯光照明:上电源插头。打开开关直到获得所需亮度。照明亮度取决于各种条件，如：眼睛适应能力等。太弱或太强都不适宜，一般情况下，不要将照明亮度调到最高强状态，否则会使灯泡在满载负荷下工作，从而缩短灯泡寿命。 ⑵ 调焦：将被观察物置于工作台中间，根据物体大小调支架与杆连接固定手轮距离，不加大物镜97mm，加大物镜50mm。后调调焦手轮，直到看清晰物象为止。调焦手轮松紧紧，由两手轮反向旋转而定，可自调、直到松紧舒适为止。 ⑶ 瞳距：为使双目观察视物相重合，可调节目镜筒和您瞳距相同。 ⑷ 视度调节：以左眼为基准，调节调焦手轮直到看清左筒像为止，右眼对右筒调节视度调节环,直到看清像为止，这样可消除您两眼视差，在您眼前将出现高质量三维图像。 ⑸ 变倍：调节变倍手轮刻度0.7～3，得您所得放大倍率，读数为:目镜倍数×变倍手轮刻度×大物镜倍数。 3. XSZ-H双目生物显微镜使用方法 ⑴ 将电源插头插入外接电源插座（插入前应检查外接电源电压与输入电源电压是否相符）。 ⑵ 先将亮度调节柄调至最小位置，开启电源开关，滑动亮度调节柄至适中位置。 ⑶ 转动物镜转换器，将10×物镜置入光路。 ⑷ 转动聚光镜升降手轮，使聚光镜上升至定位位置。 ⑸ 标本置于载物台上，用片夹固定，并借助于载物台纵横移动手轮，使观察物进入聚光镜的照明区域内。 ⑹ 拨动光栏拨杆，将孔径光栏开至中间位置。 ⑺ 用右眼观察，调焦使物像清晰（可转动粗调手轮使载物台缓缓上升至见物像轮廓，再用微调手轮精细调焦到物象清晰）。调滚花螺钉，使目镜镜场内视场光栏像居中（转动视场光栏转圈，可改变视场光样大小）。 ⑻ 瞳距及视度调节，用左目镜观察，并转动双目左目镜筒上的视度调节圈，使之成像清晰。双手握双目外壳转动，使两目镜出瞳中心距适合你的两眼瞳距，两眼图象合一为止。通过此两项调整，便可满足你的瞳距和视度要求。 4. XDS-1型倒置生物显微镜使用方法 ⑴ 将亮度调节柄调至最小位置，接通开关，再将亮度调节手柄调至适中位置。 ⑵ 将标本置于载物台上，使用低位同轴手轮可方便地操纵载物台作X、Y方向移动，并可从刻尺和游标定出观察目标的位置。载物台上可安装不同的载物片，试管压片等，以适应不同的使用场合。 ⑶ 手握转换器外缘转动转换器，将低倍物镜置入光路，通过目镜观察，使用粗微调焦手轮使标本成像清晰（当手轮向箭头所示方向旋转时，转换器向上运动）。 ⑷ 将高倍物镜置入光路，用右目镜观察，调整微动手轮使成像清晰。用左目镜观察，调整视度调节圈使成像清晰。 ⑸ 双手握左右目镜筒相对转动，可在55-77mm范围内调整双目瞳距与观察者瞳距一致（双像重合）。 ⑹ 换用所需倍数的物镜，对XDS-1型，插入活动聚光镜片，拨动视场光栏拨杆将视场光栏关小；调整聚光镜升降手轮，使视场光栏成像清晰；调整聚光镜调节螺钉，使视场光栏像与目镜视场光栏同心，并将现场光栏打开至其像在视场中刚好消失为止。 ⑺ 取下目镜直接从目镜筒中观察，用孔径光栏拨杆调整孔径光栏大小，使其像充满物镜出瞳（后光孔）的80%左右，便能获得较好的衬度。通常更换物镜时都应作此项调整。 ⑻ 调整并列的三个灯源调节手柄，使灯丝成像于孔径光栏正中（可临时放一白色纸片在聚光镜保护玻璃上观察）。 ⑼ 滤色片转盘中已装入各种颜色滤色片，转动转盘到定位位置，则转盘侧面标记色的滤色片已进入光路。 ⑽ 使用XDS-1A型时，应将选用的滤色片装入滤色片插座 ⑾ 相衬观察 ① 将环板片插入聚光镜相应插孔中。 ② 孔径光栏开至最大 ③ 相应放大倍数的相衬物镜置入光路。 ④ 在一个目镜筒中换用对中目镜观察，调节对中目镜的视度调节圈，并稍调节聚光镜升降手轮，使环板上的亮圈和相板上的暗环成像同时清晰。 ⑤ 转动环板座调节螺钉，使环板和相板的中心重合。 ⑥ 取下对中目镜，换上广角目镜，即可进行相衬观察。 ⑿ 摄影及摄像 ① 胶卷装入相机背板内，装上快门线，将摄影拉杆拉出到定位位置，放下相机里的反光镜，取景器中便能看到标本像。 ② 10X分划目镜插入目镜筒内，调整分划目镜视度圈及粗微动调焦手轮，使分划板与标本同时成像清晰。 ③ 选择适当亮度和曝光时间，将相机中的反光镜提起，即可按下快门拍摄。 ④ 摄像：旋下相机接口，换上C型标准接头，再联接好摄像头，按摄录像装置的说明书安装好摄录像系统。将摄影拉杆拉出到定位位置时，监视器上便会出现从目镜中所见的图像。 ⑤ 更换摄影或摄像目镜：为增加摄影或摄像倍率，可用选购的S6.3X摄影目镜取代已装入仪器主体中的S5X摄像目镜，方法是旋松滚花紧定螺钉，取下摄影接筒，拨出接座内的摄影目镜，换上所需摄影目镜即可。 摄像时，若需将视场中的图像全部摄入，可按上述方法换上S0.65X摄像目镜。 ⒀ 粗动松紧调节及限位：转动松紧调节手轮，可调整粗动手轮的松紧；限位手轮可以限定物镜转换器上升的最高位置，以便快速准焦。 ⒁ 更换灯泡：切断电源，松开不脱出螺钉，取出灯座，向上轻轻地拔出灯泡，再将新的灯泡小心插入即可。 ⒂ 更换保险丝：切断电源，旋下保险丝盒盖，即可更换保险丝。 5. 荧光显微镜  普通光学显微术是利用可见光使镜下标本得到照明，通过物镜和目镜系统放大以供观察。所以，我们看到的是标本的直接的本色，这里光源所起的作用仅仅是照明。荧光显微术是利用一定波长的光使镜下标本受激发产生荧光，通过物镜和目镜系统放大以供观察，所以我们看到的不是标本的本色，而是它的荧光。这里光源所起的作用不是直接照明，而是作为一种激发光。由此可知荧光显微镜的特点主要在于它的光源，即这种光源必须能供给特定波长范围的光，使受检标本的荧光物质得到必要程度的激发。 荧光显微镜多利用紫外光和短波光作光源，照射被检物后，使其激发出可见荧光。按照荧光光源位置的不同，荧光显微镜分为透射式和落射式两种。 荧光显微镜的光源一般为高压汞灯，灯泡是用石英玻璃制成的，发出的强光于激发荧光色素。仪器所用激发色素和吸收激发光的滤色镜，由研究者根据实验研究要求及显微镜类型进行选配。 荧光显微镜详细使用和操作方法见http://swzx.jlu.edu.cn   注意事项   1. 仪器应在阴凉、干燥、无尘、防震、无酸碱蒸汽的环境里使用。 2. 仪器出厂时均经严格校正，不得自行拆御。 3. 使用和搬运时，动作要轻，避免强烈振动和碰撞。 4. 外露镜片表面不得用手触摸，其上的灰尘污物可用洗耳球或柔软毛刷去除，必要时可用清洁软布沾少许二甲苯或酒精乙醚（3:7）混合液擦试。 5. 外接电源必须有接地线。 6. 使用高倍物镜时，标本的盖玻片厚度应满足设计要求的0.17mm，误差不大于±0.01mm，否则影响图像清晰度。 7. 不得在载物台上放置过重物体，以防载物台变形。 8. 仪器不工作时应切断电源，罩好防尘罩。停用时间较长时，最好将物镜、目镜、双筒目镜组、照像机等从主机上取下放入干燥器中，同时在主机上盖上相应的防尘盖，再用防尘罩罩好。 　

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